Perbedaan
hasil basecaller antara ABI KB dan PeakTrace (image from nucleics.com)
Dalam tulisan terdahulu yang
berjudul Troubleshooting Guide.
‘Keanehan-keanehan’ pada Electropherogram, kita bisa tahu bahwa
tidak selamanya hasil pembacaan alat DNA sequencer kualitasnya baik. Nah, jika
kebetulan electropherogram sampel kita jelek, jangan dulu frustasi, mungkin
masih ada jalan keluar untuk meningkatkan kualitas electropherogram sehingga
dapat terbaca dengan baik. Memang tidak semua electropherogram yang jelek bisa
diselamatkan, jika kualitasnya sangat parah tentu jangan berharap bisa
‘disulap’ menjadi bagus. Tapi jika kualitas awalnya cukup bagus, bolehlah
berharap kekurangannya dapat diperbaiki.
Software
Basecaller
Kualitas electropherogram dapat
ditingkatkan dengan menggunakan perangkat lunak (software)basecaller,
software ini berfungsi untuk menterjemahkan data mentah (raw data)
pembacaan laser pada mesin sequencer menjadi peak-peak electropherogram yang
dapat dibaca komputer dan manusia (trace file). Selama ini pun setiap
komputer mesin sequencer pasti memiliki software basecaller ini, namun
kemampuan mereka masih ‘standar’ dan masih ada celah untuk ditingkatkan lagi.
Beberapa software basecaller yang sangat terkenal yaitu Phred, TraceTuner, KB
Basecaller dan PeakTrace. Semuanya dapat memproses data
electropherogram yang dihasilkan oleh mesin sequencer bermerk ABI (Applied
Biosystems, USA) berbagai tipe.
Pemrosesan
Trace File vs Raw Data
Bagaimana software-software
basecaller itu bekerja? Mari kita selidiki:
§ Phred dan TraceTuner bekerja
dengan melakukan re-basecalling data peak yang sudah diproses dalam trace file
(bukan raw data), sehingga akurasi basecalling mereka sangat bergantung pada
kualitas peak yang dihasilkan oleh ABI data collection software.
§ KB Basecaller adalah software basecaller
yang terintegrasi pada beberapa “Data Collection Software” bawaan mesin
sequencing ABI generasi baru seperti seri 3100 dan 330/xl. Raw data diproses
oleh KB Basecaller hingga menghasilkan trace file lengkap dengan Quality
Value (QV) dari peak-peaknya.
§ PeakTrace —seperti halnya KB
Basecaller— bekerja dengan memproses kembali langsung dari raw datanya, namun
dengan kelebihan yaitu mampu membaca raw data mesin generasi lama seperti ABI
seri 3700 dan 377, yang sudah tidak didukung lagi oleh KB Basecaller. Dengan
prinsip kerja seperti ini, PeakTrace bisa memberikan basecall yang lebih baik
secara signifikan denganerror lebih sedikit dan pembacaan yang
lebih panjang.
Dari keempat software di atas,
kita akan membahas PeakTrace saja, selain tersedianya versi
gratis, software ini pun diklaim memberikan output yang lebih baik.
PeakTrace
Peak trace dapat diakses langsung
dari websitenya (www.nucleics.com)
secara free alias gratis, tapi dibatasi maksimum 10 file yang dapat di-trace
per hari. Jika jumlah file Anda sangat banyak dan rutin, Anda bisa menggunakan
versi berbayar. PeakTrace dapat menangani electropherogram dari berbagai jenis
mesin ABI baik keluaran baru atau lama, dan mesin sequencer MegaBACE.
Langsung
Praktek
Untuk men-trace electropherogram
menggunakan layanan PeakTrace gratis online, ikutilah langkah-langkah berikut,
sangat simple:
§ Buka halaman PeakTrace service online.
§ Klik tombol ‘Choose…‘
untuk mencari file electropherogram yang akan Anda trace (format *.ab1 atau
*.abi). Anda dapat mengunggah (upload) 1 atau 2 file sekaligus.
§ Tekan tombol ‘Upload Traces‘.
§ Tunggulah sekitar 5-20 detik
(waktu tunggu bergantung pada jumlah dan jenis trace dan juga load server saat
itu).
§ Klik link ‘Go to the PeakTrace
basecalling results page now’.
§ Hasil trace siap untuk diunduh
(download) dengan mengklik link file output (sama dengan nama file yang anda
submit).
Berikut ini adalah contoh tracing
yang berhasil menggunakan PeakTrace. Nilai Q20+ meningkat sebesar 169 poin (32.50%).
Bandingkan antara peak-peak sebelum (atas) dan setelah di-PeakTrace (bawah),
terasa sangat membantu bukan?
Selalu
berhasilkah?
Seperti telah disinggung di awal
tulisan, tidak semua electropherogram dapat ditingkatkan kualitasnya
menggunakan PeakTrace maupun software basecaller lainnya. Faktor utama yang
membuat peak tidak dapat diperbaiki adalah:
§ Panjang pembacaan. Untuk sampel DNA yang pendek,
dimana pembacaan oleh KB Basecaller sudah sempurna maka kualitasnya tidak dapat
ditingkatkan lagi oleh PeakTrace. Jadi kalau electropherogram Anda sudah bagus
tidak perlulah ditrace lagi, hanya membuang waktu dan energi. Kemampuan
PeakTrace akan lebih terasa pada sampel DNA yang cukup panjang dimana biasanya
resolusi peak electropherogram pada bagian belakang (mendekati ujung 3′) sudah
berkurang.
§ Kekuatan signal raw data. Jika signal sangat lemah
(mendekati level signal noise) maka PeakTrace tidak akan mampu berbuat apa-apa
lagi. Kekuatan signal sangat penting terutama pada bagian ujung 3′. Ingat bahwa
tugas PeakTrace adalah meningkatkan kualitas peak yang sudah cukup bagus, bukan
membuat peak yang jelek jadi bagus.
§ Kegagalan reaksi sequencing. Sudah pasti, PeakTrace dan
software basecaller lainnya bukanlah pesulap yang dapat membuat suatu reaksi
sequencing yang tidak terjadi menjadi seolah-olah berhasil. Signal yang
bercampur akibat adanya dua template atau lebih. Kalau sudah begini, meskipun software
basecaller mampu men-trace-nya, tetapi hasilnya tetap saja tidak berguna dan
tidak memberikan hasil apa-apa.
Komentar:
Pada artikel tersebut, dibahas
tentang pembacaan hasil tes DNA yang telah ditambahkan oleh software baru
sehingga dapat memberikan hasil yang lebih baik. Software yang dibahas bernama “PeakTrace”
yang berguna untuk meningkatkan kualitas Electropherogram yaitu alat untuk
membaca trace DNA. Dengan bantuan bioinformatika yang dalam hal ini adalah
membuat suatu software untuk meningkatkan hasil kualitas dari suatu tes DNA
akan sangat membantu dalam pembacaan hasil tes DNA yang hanya berupa trace
(grafik). Selain itu software ini juga diberikan secara gratis sehingga mengurangi
anggaran biaya untuk membeli alat yang lain. Menurut saya, kemajuan teknologi
di bidang biologi sangat penting. Kemajuan teknologi baik dari sisi hardware
ataupun software yang dihasilkan dapat mengurangi anggaran dan mengefisiensi
tenaga manusia yang dibutuhkan. Kemajuan teknologi yang pesat ini akan sangat
membantu dalam kemajuan di segala bidang dan aspek kehidupan manusia.
Ditulis oleh:
Gina Devita Syabrina
53409423
4IA07
Tidak ada komentar:
Posting Komentar